研究芽孢杆菌对梨灰霉和青霉病菌的抑制作用

摘要：[目的] 明确贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）L-1对梨灰霉和青霉病菌的抑制作用，明确菌株L-1无菌发酵液拮抗活性的稳定性及可能的拮抗机制。

[方法] 通过离体测定、活体测定和病原菌菌丝形态观察，评价菌株L-1对梨灰霉和青霉病菌的拮抗活性。以梨灰霉病菌为供试病原菌，利用牛津杯法测定菌株L-1无菌发酵液拮抗活性的稳定性。利用Pacbio RSⅡ三代测序技术测定L-1的全基因序列，将全基因序列与基因蛋白质序列数据库进行BLAST比对分析，预测菌株L-1可能产生的次生代谢产物及潜在的作用机制。

[结果] 菌株L-1对梨灰霉和青霉病菌的活体抑制率分别为92.88%和77.47%，能引起病原菌菌丝膨大、畸形。菌株L-1在含10% NaCl的培养液中仍能正常生长，其无菌发酵液耐高温、酸、碱、紫外照射和蛋白酶降解，对病原菌具有稳定的拮抗活性。全基因序列分析结果显示菌株L-1有112个基因参与了多种碳源的代谢，可以利用多种碳源进行生长；含有参与亚精胺、海藻糖等与菌株抗逆性相关化合物合成的基因；次生代谢产物预测结果显示：L-1含有合成surfactin、fengycin、bacillibactin、bacillaene、macolactin、difficidin、bacilysin等多种肽聚糖和聚酮糖类抗性化合物的基因簇，以及能够降解病原菌细胞壁的β-1，3-葡聚糖酶和几丁质酶相关的基因；此外菌株L-1含有生成乙偶姻等能够诱导植物抗性的基因。

[结论] 菌株L-1能有效拮抗多种梨果采后病害，抗逆性强，拮抗活性稳定，预测菌株L-1能够通过产生多种拮抗活性化合物和细胞壁水解酶类以及诱导植物抗性实现防病效果，具有很大的应用潜力。 

我国是世界上最大的梨生产和出口国，2016年我国梨果总产量达到1930万t，占到世界总产量的75%。梨果含水量大、表皮脆弱并且内含物丰富，在生长和储藏过程中容易受到多种病原物侵染，引起腐烂变质，导致果实品质降低或失去经济价值。例如，梨灰霉病菌(Botrytis cinerea)和青霉病菌(Penicillium expansum)能够从梨果伤口侵染果实，分别引起梨灰霉病和青霉病，造成严重损失。目前对梨果病害的防治主要采用化学药剂，如在幼果期、果实生长中期和采收前施用多菌灵、退菌特、乙磷铝、甲基硫菌灵等有机磷杀菌剂或波尔多液，而对其生物防治的研究较少。

作者在前期研究中筛选出对梨轮纹病菌(Botryosphaeria berengeriana)具有显著拮抗活性的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) L-1。菌株L-1能够抑制梨果轮纹病害的扩展，诱导果实抗性相关酶(POD、CAT)的表达，并且具有较广的抑菌谱，可以在果实伤口中快速克隆和繁殖，具有很大的应用潜力。芽孢杆菌属具有非常相似的生理和分子特性，最近一些芽孢杆菌属的菌株被重新分类，其中Bacillus methylotrophicus与B. amyloliquefaciens subsp. plantarum被划定为Bacillus velezensis的同物异名，因此菌株L-1被重新命名为贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis L-1)。贝莱斯芽孢杆菌L-1对梨灰霉和青霉病菌的防治效果、防治效果的稳定性及其拮抗机制仍需进一步研究。随着DNA测序技术的发展，以及集高通量、快速度、长读长及低成本等多种优点于一身的第三代测序技术的出现，为从基因组学角度研究微生物提供了快速简便的途径。